Nuestras primeras “churri-estructuras”

En nuestra última sesión entendimos cómo contar lo que estamos haciendo. Vamos!!! Lo que hemos hecho.

Y es que, si analizamos nuestro recorrido, vemos que hemos ido

reduciendo (afinando) nuestra mirada.

Empezamos con …

1) Vamos a trabajar con “retrones”, identificarlos… Pero…

no todos, ya que hay grupos donde no hay descrito ningún ejemplo. Por tanto nos hemos centrado en un grupo nuevo muy concreto:

2) los III-A3 que se caracterizan por tener esta estructura de dos genes:

La RT y una proteína efectora la PRTase-WH.

3) Tenemos inicialmente 143 candidatos, pero …  ¿¿vamos a trabajar en todos???, no. Solo en 4 grupos (A-D) semejantes entre sí pero suficientemente distintos. Grupos que nos permiten entender el grado de conservación entre los dos genes y observar que evolucionan de manera paralela: las distancias entre ellos son semejantes… (nuestras matrices…).

Y por último nos hemos metido en la tarea de describir la estructura del msDNA que se encuentra en la región intergénica de cada locus…

Tras varias comparativas nos hemos quedado con el grupo D que ejemplifica mejor la búsqueda del retrón característico del grupo III-A3.

Y, Ya tenemos nuestra primera churriestructura, la del retrón 1340 encontrado en el genoma de un aislado de la especie Pseudomonas aeruginosa.

Se trata de que al final dibujemos la estructura del retrón 1340 y le pongamos nombre!!!!

Importante ya entendemos la direccionalidad de cada una de las hebras del retrón (la direccionalidad 5’ y 3’).

Vamos que ya sí se ve nuestro final!!!!

Enfrentandonos a “nuestros” retrones

Ya estamos viendo que identificar retrones no es una tarea sencilla, verdad???

Efectivamente, si miráis en detalle lo que se ha querido decir en la figura 1 de la entrada del Martes 22 de Febrero del blog se observa que la identificación de un retrón no es sólo obtener la estructura predicha en el RNA fold, sino que es todo un conjunto de evidencias. A saber: 

• Debe existir una interacción a modo de cremallera: principio y final, a2-a1

• Debe existir un cierto grado de conservación de nuestras secuencias (alrededor del 80% o superior).

• Debe existir tras la cremallera a1-a2 las famosas dos Gs, generalmente desapareadas y críticas en la formación del cDNA del retrón.

• El cDNA del retrón (principalmente b1 y b2) se debe de formar en una región muy estructurada (un brazo largo).

Por todo ello, a la hora de enfrentarse a la estructura del retron de un locus concreto se debe de actuar de la siguiente manera:

La estructura que manda es la de la secuencia consenso. Por tanto:

a. sale parecida al consenso. Lo usamos de estrategia para definir las distintas partes del retrón.

b. No sale como el consenso, pues usamos los alineamientos para definir las distintas partes del retrón. Y una vez identificadas, subdividimos las distintas partes para saber si interaccionan… .

Para que todo sea más sencillo, conviene que alineemos las 7 secuencias de los retrones usando la consenso como referencia. (en el documento de texto adjunto os envio las secuencias para que las alineis). Y uséis el formato viena de la consenso para definir la estructura.
Os propongo que identifiquéis en base a esta figura todas las partes del retrón en cada locus (y lo anotéis en el clone manager).

Figura 1: Alineamiento de los 7 locus del grupo D. El formato viena está basado en la consenso y define los distintos dominios de interacción. Donde están las Gs?, donde está la cremallera a2 y a1, donde la b2 y b1. Donde empieza y donde presumiblemente acaba el retron cDNA??? – echad un vistazo a las entradas previas.

Y ese final que parece que nunca llega!!!!, llegará, llegará ya veréis.

Primeras metas. Nuestro guión/dando forma al trabajo

Otra de las cosas que se comentaron en la última reunión era que ya tenemos una primera fecha “límite:

En ella deberemos de ser capaces de contar todo nuestro trabajo en 10 min y en Inglés. En este magnífico congreso. Para ello contaremos tb con una presentación (powerpoint) que resumirá todo nuestro trabajo. Tb deberemos realizar un poster para esas fechas…

Pero…,  para contar nuestro trabajo, primero debemos de ordenarlo de manera escrita. Os recomiendo que le echéis un vistazo en recursos a los trabajos previos, sobre todo al del año pasado que se titulaba: “Bioinformatic analysis of specific groups of prokaryotic reverse-transcriptases”.

Debemos de ser capaces, de momento de escribir algo parecido… Pero, este año hemos llegado más lejos… . De hecho ya podemos ir pensando en un posible título, aunque esto lo tendremos que discutir en una reunión…

Todo trabajo debe de tener:

Resumen, Introducción, Material y Métodos, Resultados, Discusión y Conclusiones. A su vez estos trabajos tienen un apartado de “my own ideas” donde tendréis que hacer una lectura más personal de lo que habéis hecho. Sabiendo además que lo que tenéis que escribir forma parte tb de vuestro “proyecto” en el Instituto para el curso que viene (40 pgs o así), podemos plantear en él también una estructura similar.

    Por el momento deberéis centraros en los apartados M y Métodos y Resultados. Saber qué vamos a contar en estos apartados definirá posteriormente la Introducción. Para la Introducción tendré que ayudaros y guiaros más en detalle. Podéis ir viendo las primeras presentaciones; son la verdadera introducción de donde nos hemos metido. Estos tres apartados definirán subsiguientemente los Objetivos del trabajo que no son necesariamente iguales a los que teníamos planteados “Definiendo y estudiando ‘retrones’” pero que no andarán muy lejos. El Resumen y la Discusión se abordarán cuando estos apartados estén ya definidos y casi completos.

A modo de ejemplo y para empezar, en Mat y Meth. Debemos de explicar:

Como Material: Las secuencias con las que hemos trabajado (de donde provienen. Habrá que añadir una tabla).

Como Métodos:

-El programa clone manager. Que hace, que interpreta, como trabaja…

-los programas de busqueda, blast… creo que los hemos usado tb…

-los programas de la universidad de Viena RNA web services (RNA fold y RNAalifold).

-Si terminamos usando el varna, habrá que ponerlo tb (de momento no es seguro)

Por supuesto, en todo momento hay que tener en cuenta la bibliografía… Dos trabajos van a ser sin duda referidos:

- Simon AJ, Ellington AD, Finkelstein IJ. Retrons and their applications in genome engineering. Nucleic Acids Res. 2019. 47:11007-11019. Donde describen de una manera muy actual qué es un retron.

- Mestre MR, González-Delgado A, Gutiérrez-Rus LI, Martínez-Abarca F, Toro N. Systematic prediction of genes functionally associated with bacterial retrons and classification of the encoded tripartite systems. Nucleic Acids Res. 2020. 48:12632-12647. Donde se describe el sistema de retrones tipo III-A3 en el que hemos trabajado.

Os recomiendo de nuevo que le hagáis un buen vistazo al blog desde el principio hasta hoy y os daréis cuenta de todo el camino recorrido y será una buena manera de ver como lo resumimos y contamos!!!! Y como siempre soy todo oídos, bien por aquí, bien por el mail, bien a través de vuestro profesor Javier.

Ánimo!! Ya se vislumbra el fin de nuestro trabajazo!!!!!

Y nos vamos de fallas!!!!!

El pasado Viernes tuvimos una nueva sesión de trabajo. Confiemos en que sea ya de las últimas. De hecho se tomaron decisiones importantes.

Tras varios intentos de determinar distintas estructuras en los 4 grupos de genes correspondientes a ejemplos de sistemas III-A3 de retrones: A-D, hemos comprobado que el que mejor ejemplifica las estructuras de este grupo son los 7 representantes del grupo D:

Tabla 1: representando los locus que vamos a mostrar completos y sus microorganismos de procedencia

En resumen, tenemos que identificar para cada uno de los locus del tipo D su “retron”, Para ello debemos de hacer dos cosas:

(i) estructura en el clon manager, (para hacerlo debemos tener en cuenta el formato viena para cada locus y el consenso tb. Una vez teniendo claro el RNA estructurado que se forma debemos de deducir donde empieza y acaba el cDNA del retrón.

Figura 2: Ejemplo Anotación en el clon manager de algunas de las distintas partes del retrón (msRNA ó ncRNA, a2, a1, b2, b1, cDNA (retrón propiamente dicho).

Que mirado en esquema sería algo así:

Figura 3: Esquema lineal de las distintas partes anotadas

Que recuerda y mucho a lo publicado en el artículo ejemplo de recursos… (https://drive.google.com/file/d/1daXnOuomfPEV8rVBwfp7FAIe0seOmUZf/view).

(ii) Por otro lado y como os dije se trataría de realizar la figura de cómo queda el retrón completo y estructurado, que finalmente debemos de ponerle nombre.

Para ello, necesitamos la secuencia intergénica específica de cada locus, el formato viena estructurado (consenso) y particular. Si no coinciden tendremos que hacer caso del consenso… 

Figura 4: Formato viena de la estructura que resulta del alineamiento general (consenso) y del retrón 1337. Hay que observar que aunque las estructuras se parecen  mucho no son idénticas.

Ya tenemos un norte sobre el que definir y terminar nuestro trabajo que no era otro que definir y caracterizar los retrones de los sistemas III-A3.

Figura 5: Fijándonos en la secuencia específica y girando las estructuras debemos de “dibujar” el retrón resultante de los locus: 1337-1342.

Ánimo, que hasta nos da tiempo a ir de fallas!!!